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Anfragen: Kurt.Frischknecht@unisg.ch

Die Anzucht von Mikroorganismen

Inhaltsübersicht 1. Nährmedien (Bakteriennährboden, Pilznährboden) 1.1. Einleitung 1.2. Herstellen von Nährmedien 1.3. Ziel 1.4. Materialliste 2. Durchführung: Herstellung von Nährmedien 2.1. Sterilen Nähragar herstellen: Bakteriennährboden "Nähragar" Pilznährboden ("Pilzagar") 2.2. Giessen der sterilisierten Nährböden 2.3. Beimpfen mit Organismen 3. Auswertung 4. Entsorgung Abb. 1: Dampfdrucktopf (Schnellkochtopf) als Ersatzautoklav Abb. 2: Das Arbeiten und das Giessen von Nähragar in einer keimarmen Umgebung zwischen zwei brennenden Bunsenbrennern ersetzt die Sterilbench Abb. 3: Beimpfen der Nährbodenplatten. A: S-förmiger Impfstrich. B: Impfstrichführung beim Fraktionieren (Vereinzeln der Zellen) auf dem Agar Abb. 4: Protokollblatt

 

 1.      Nährmedien (Bakteriennährboden, Pilznährboden)

1.1.    Einleitung

Will man Informationen über Wachstum, Vermehrung und spezielle Stoffwechselleistungen von Mikroorganismen erhalten, muss man sie kultivieren. Die Kultivierung erfordert die Herstellung von Nährmedien und deren Sterilisation sowie die Übertragung der Mikroorganismen von einem Medium auf oder in ein anderes Medium. Diese Übertragung wird mittels unterschiedlicher Impftechniken vorgenommen.

In Kultur befindliche Mikroorganismen können mit spezifischen Methoden hinsichtlich ihrer Stoffwechselaktivität untersucht werden. Man erhält Auskunft darüber, welche Produkte von den jeweiligen Mikroorganismen gebildet werden (z. B. Bildung von Antibiotika, Enzymen), welche Stoffe von ihnen in einer bestimmten Zeit abgebaut werden (z. B. Abbau von Zellulose) und wie diese Prozesse durch die Umweltbedingungen beeinflusst werden.

1.2.     Herstellen von Nährmedien

Eine Voraussetzung für die Kultivierung von Mikroorganismen ist die Bereitung von Nährmedien. Nährmedien werden entweder in flüssiger (Nährlösung) oder in fester Form (Nährboden) benötigt. Zu ihrer Herstellung braucht man Nähragar, Nährbouillon (evtl. fettfreie Bouillon), Biomalz (Malzextrakt), Pepton, Hefeextrakt, Agar und Gelatine sowie verschiedene andere organische und anorganische Substanzen (als Zusätze). Wenn Nähragar I vorhanden ist, kann auf Nährbouillon I, Pepton und Agar und andere Zusatzstoffe weitgehend verzichtet werden.

Nähragar I besteht aus Agar und Trockennährbouillon (Pepton, Eiweisshydrolysat, Hefeextrakt, Kochsalz). Dieses kohlenstoff- und stickstoffhaltige Substanzgemisch dient vor allem zur Herstellung von Nährböden für Bakterien.
Biomalz (Malzextrakt) enthält vorrangig die Kohlenhydrate Maltose und Maltodextrine, die ein wertvolles Substrat für das Wachstum von Pilzen darstellen.
Peptone sind bereits teilweise abgebaute Eiweisskörper, die manchen Nährmedien als Stickstoffquelle zugesetzt werden.

Agar ist ein pflanzliches Verfestigungsmittel. Wenn man es einem flüssigen Nährmedium zugibt, entsteht ein fester Nährboden, der sich erst bei 82°C verflüssigt. Agar wird vorwiegend aus bestimmten Rotalgen gewonnen. Er stellt ein Gemisch aus verschiedenen Polysacchariden dar. Ausserdem enthält er geringe Mengen Stickstoff, Phosphor, Calcium und Magnesium.
Gelatine dient wie Agar als Geliermittel zur Herstellung von Nährböden und wird aus tierischen Häuten, Knorpeln und Knochen gewonnen. Die wichtigste in der Gelatine enthaltene Substanz ist das Glutin, eine eiweissähnliche Verbindung. Gelatinehaltige Nährböden werden bei Temperaturen über 23 °C flüssig und können deshalb nur unterhalb dieser Temperaturgrenze genutzt werden.

Insbesondere unter schulischen Bedingungen können verschiedene natürliche Substrate wie Kartoffel-, Brot- und Karottenscheiben mit gutem Erfolg zur Kultivierung für manche Mikroorganismen verwendet werden.

Da die verschiedenen Mikroorganismen unterschiedliche Nährstoffansprüche stellen, müssen viele Nährmedien eine bestimmte chemische Zusammensetzung aufweisen. Sie werden im allgemeinen wie folgt hergestellt:

- Einwägen der Bestandteile nach Vorschrift
- Zugabe von Wasser und anschliessendes Vermischen
- evtl. Kochen unter Rühren, bis sich die Bestandteile gelöst haben
- etwas abkühlen lassen und den pH-Wert kontrollieren und notfalls einstellen
- Verschliessen der Gefässe mit Watte- oder Zellstoffstopfen und Sterilisieren.

Für schulische Zwecke reicht in den meisten Fällen die Herstellung eines Kollektivnährbodens für Bakterien beziehungsweise für Pilze aus.

1.3.    Ziel

Mit einfachsten Hilfsmitteln soll die Herstellung steriler flüssiger Nährlösungen (Nährbouillon) und fester Nährmedien (Nähragar, Pilzagar) eingeübt werden. Als Ersatz für einen teuren Autoklav wird ein Dampfkochtopf eingesetzt, statt Reinluftkabinett (Sterilbench) wird ein UV-Kabinett eingerichtet oder zwischen zwei brennenden Bunsenbrennern gearbeitet. Hauptziel dieser Übung ist die "Hürde der Steriltechnik" mit schulischen Mitteln zu überwinden.

Zum kommerziellen Nähragar (Rezept 2.1.1) oder zum selbstgemachten Nähragar (Rezept 2.1.2) Malzextrakt dazugeben: 1.5 g Malzextrakt auf 100 mL Nähragar. Sterilisieren wie unter Rezept 2.1.1. beschrieben.

2.2.    Giessen der sterilisierten Nährböden

Sobald der Dampfkochtopf geöffnet werden kann , entnimmt man den Erlenmeyerkolben mit dem heissen, sterilen und flüssigen Nährboden und giesst an einem windgeschützten Ort (z.B. mit Alufolie ausgekleidete und unmittelbar vorher mit reichlich 70%igem Alkohol getränkten Linsoft-Tüchlein abgewischte Schulzimmerecke, am besten zwischen zwei brennenden Gasbrennern [vgl. Abb. 2]) soviel Nähragar in die sterile Petrischale, so dass der Petrischalenboden gerade bedeckt bedeckt wird (ca. 20 mL Nährboden).

Abb. 2: Das Arbeiten (A) und das Giessen von Nähragar (B) in einer keimarmen Umgebung zwischen zwei brennenden Bunsenbrennern ersetzt die Sterilbench.

Hinweise:

1. Sterile Petrischalen: entweder kauft man sie bereits steril in 10-er Packungen als Kunststoffpetrischalen, oder man erhitzt im Backofen Glaspetrischalen während ca. 30 min bei 180 °C.

2. Giessen: der Nähragar muss im heissen Zustand gegossen werden, evtl. beim Anfassen des noch heissen Erlenmeyerkolbens Hand- resp. Arbeitshandschuhe tragen.

3. Keimarme Umgebungsbedingungen: die zwischen zwei brennenden Gasbrennern heisse Luft strömt nach oben und verhindert das Eintragen von Luftkeimen auf die zu giessenden Nähragarplatten!

4. Vorsicht vor Kontamination: Deckel der Petrischale während des Giessens nur wenig anheben, nicht auf den Tisch ablegen, nach dem Giessen Petrischale wieder zudecken und warten, bis der Agar erstarrt ist.

5. Aufbewahrung der Nährbodenplatten: eingepackt in einen gut zugeklebten Plastikbeutel, agargefüllter Bodenteil nach oben orientiert, können die erstarrten Agarplatten während mehrerer Wochen im Kühlschrank gelagert werden.

6. Störendes Kondenswasser: vor dem Einsatz im Experiment sollten die Nährboden während ca. einem halben Tag auf Raumtemperatur gebracht werden, damit das sich störende Kondenswasser wieder mit dem Nähragar vereinigt.

2.3.    Beimpfen mit Organismen

2.3.1. Sterilitätskontrolle

Von jedem Nährbodentyp eine beschriftete Platte während ca. 2 Tagen bei Raumtemperatur stehen lassen (bzw. bei 25 ⁰C bis 28 ⁰C im Brutschrank bebrüten). Kontrolle, ob die Platten steril (= unbewachsen!) bleiben.